ELISA原理
今后的发展方向
●聚苯乙烯表面的高级制备。已有的技术是酰肼化(聚二氟乙叉，PVDF);生物素化;预包被多聚赖氨酸等，均是专利产品。
●酶促信号放大的改变，如酶促荧光、酶促化学发光等。
ELISA临床意义
●各型肝炎的特征及标志物
乙肝二对半的模式及临床意义
HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb &n bsp; 临床意义
+ + - - - - 急性HBV感染早期HBV复制活跃
+ + + + - - 急慢性HBV感染，HBV复制活跃
+ - + + - - 急慢性HBV感染，HBV复制中跃
+ - + + + - 急慢性HBV感染，HBV复制低跃
+ - + - + - HBV复制停止或极低
- - + + - - 平静的HBV携带状态，HbsAg
- - + - - - HBV既往感染，未产生抗-HBs
- - + + + - 抗HBs出现前期，HBV复制低
- - + - + + HBV感染恢复期
- - + - - + HBV感染恢复期
+ + + + - + 不同亚型HBV再感染
+ - - - - - HBV-DNA整合
- - - - - + 病后或接种疫苗后获得免疫
试剂盒选择
◎卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产 品，试剂应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。
◎灵敏度：有二层含义，1)为试剂检出被检物质的最低量的能力;2)为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力(假阴性越少越好) ，取决于包被物的全面性。
◎特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力(无假阳性)，取决于包被抗原(体)及标记抗原(体)的纯度及特异性。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%;定量试剂应同时考察线性范围
试剂盒选择
◎稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37℃保存，定期测定其灵敏度，特异性和精密度等指 标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为37℃每稳定一天相当于4-10℃保存一个半月。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了，)定量试验结果计算也 应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。
试剂盒评价
◎试剂评价需要有权威的血清考核盘( Panel)进行检测，一般实验室不易从生检所或临检中心取得，每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进行选 择。
◎根据该试剂生检所批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂;
◎通过询问试剂包被物的组成，如原料来源(基因工程或合成多肽)，片段的组合(按比例混合或化学合成)，片段的长短等判断试剂的 优劣;
◎参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果，这比较客观公正，因为统计数字均来自各参评医院，反映了试剂在某一地区的使用情况;
◎根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。
仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序(SOP)，所要控制的仪器包括移液器(加样枪)，水浴箱(温箱)，洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小(5-100ul)，其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内;
◎水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中(或温箱内)实测温度是否一致，允许有±1℃的误差;
◎洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞;
◎酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
附1：酶标仪校正程序
◎滤光片波长精度检查：将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201型紫外-可见分光光度计(波长精度±0.3nm)于 可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。
◎通噵差与孔间差检测：通道差检测是取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体， 将其(内含200ul甲基橙溶液吸光度调至0.500A左右)置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，1于490nm处连续测三次 ,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条(8条共96孔 )分别加入200ul甲基橙溶液(吸光度调至0.100A左右)先后置于同一通道，蒸溜水调零,于490nm处检测，其误差大小 用±1.96s衡量。
n 零点飘移(稳定性观察)：取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均加入200ul蒸溜水并调零，于490nm处每隔30分钟 测一次，观察各个通道4小时内吸光度的变化。
附1：酶标仪校正程序
◎精密度评价：每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同.浓度的甲基橙溶解，蒸溜水调零，于490nm作双份平行测定 ，每日测二次(上下午各一次)，连续测定20天。分别计算其批内精密度，日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV值。
◎线性测定：用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液，于490nm平行测8次，取其均值。计算其回归方程，相关系数及标准 估计误差s，并用±1.96s表示样品测量的误差范围.双波长测定评价：取一分甲基橙溶液，分别加入3种不同浓度的溶血液(测定 波长为490nm，校正波长为585nm)，先后于8个通道检测，每个通道测3次，51比较各组之间是否具有统计学差异，以考察 双波长消除干扰组分的效果。
◎一般酶标仪无585nm滤光片，可选用550nm或630nm滤光片。450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液(校正波长为630nm)
常见酶标仪评价
标本的采集和保存
◎可用作 ELISA的标本十分广泛，体液(如血清，血浆，各种积液)，分泌物(如唾液)和排泻物(如粪便，尿液)均可作为标本以测定其中 的抗原或抗体成分，一般使用血清。
n 标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性;长菌的标本同样的道理易 产生假阳性。
◎抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。
◎标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需保存一周以 上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。
◎ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫 后做生化.
附：内外干扰物质的影响分析
溶血 脂浊 RF 自身抗体 AFP 补体 & nbsp; 肝素 ; EDTA
A 0.165 0.200& nbsp; 0.250 &n bsp; 0.264 &nb sp; 0.186 0.146 0.183 0.126
S 0.023 0.016& nbsp; 0.007 &n bsp; 0.029 &nb sp; 0. 010 0. 007 0.019 &nbs p; 0.013
A对照0.151 0.195 ;0.195 0.195 & nbsp; 0 .116 0.116 0.116 0.116
S 0.038 0.008& nbsp; 0. 008 0.008 &nbs p; 0.018 0.018 &n bsp; 0.018 0.018
P > 0.05 > 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 <0.01 <0.01
分析中质控
◎ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的 高灵敏，强特异的优点。
◎因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。
加样
◎加样应用微量移液器(加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。
◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注 意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。
温育
◎抗原抗体反应需要在一定温度下(37°C)，经过一定的时间才能达到反应的平衡点
◎ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能 使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠 加放置。
◎边缘效应(2ng/mlHBsAg一步法三种不同温育法的结果)
洗涤
◎ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球 、细菌中的酶干扰清除掉。
◎手工洗涤一般采用浸泡方法：1)甩去孔内反应液;
2)用洗涤液过洗一遍(即注满孔后即甩去);
3)微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动;
4)甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。
重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
◎洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的 浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。
显色
◎HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度(一般为37°C，10-15分钟)恒定反应后终止
◎或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间.
酶标仪判读结果
◎显色反应终止后应立刻比色(30分钟内)。
常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色， 测定波长为490nm;
TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，
二种底物的校正波长均用6 30nm。
使用双波长的优点可以消除 反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。
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